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T4 DNA 连接酶 (M001)

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产品描述:
T4 DNA连接酶常用于催化双链DNA平末端或互补粘性末端之间的 连接反应,也能催化双链RNA 5´ -磷酸末端和3´ -羟基末端间的连 接。还可以修复双链DNA、RNA或DNA/RNA杂交双链中的单链切口。以上 反应均需消耗ATP。
产品特点:

随酶附带10×T4 DNA Ligation Buffer及独特配方的2×Quick Ligation Buffer提供给您更多的选择:而使用10×T4 DNA Ligation Buffer,16℃过夜连接可获得最高的连接效率;使用快连Buffer在室 温(25℃)下,仅需5分钟即可完成粘性末端或平滑末端DNA片段的连接 反应。

产品用途:
  • DNA片段和载体DNA的连接。(参见实验方案)。
  • DNA片段和Linker或Adaptor DNA的连接。

使用建议:

  • 粘末端的连接反应:插入片段和载体的摩尔浓度比特别重要,此比例在2-6之间最好,低于2:1就会导致较低的连接效率,高于6:1则会导致多个插入。摩尔比请按载体与插入片段DNA浓度及分子大小来计算。
  • 平滑末端的连接反应:平滑末端的连接反应与突出末端相比反应较慢(其Km值约为突出末端的100倍)。进行平滑末端的连接反应时,可提高DNA浓度,将使用酶量增加到突出末端量的2~5倍左右。
  • 向粘粒或噬菌体进行连接反应:可使载体和插入DNA的摩尔比调整为1:1,同时增大DNA浓度以便取得良好效果。(0.05~0.1μg/μl以上)
  • 反应温度: 该酶的最适温度为37℃,由于热稳定性较差,因此 长时间反应时通常需在16℃下进行。若反应1-2小时左右的话也可在室 温下进行反应。
  • 抑制剂:T4 DNA连接酶要求Mg2+,因此螯合Mg2+的EDTA的存在会阻碍反应。将溶解于含有高浓度EDTA缓冲液中的DNA准备作为样品使用 ,最好先用灭菌蒸馏水或TE缓冲液进行置换。
应用实例:
T4 DNA 连接酶
图 例 1 ) 在25℃,用不同活性单位(2U、4U、6U)T4 DNA连接酶与λDNA/Hind III 片段作用10分钟后的结果以及连接产物灭活T4连接酶后再次使用Hind III酶切结果。
泳道1:λDNA/Hind III;
泳道2:λDNA/Hind III+2U T4 Ligase;
泳道3:λDNA/Hind III+4U T4 Ligase;
泳道4:λDNA/Hind III+6U T4 Ligase;
泳道5:λDNA/Hind III ,T4 Ligase连接产物,Hind III酶切
产品包装:
组成 体积
T4 DNA连接酶 (350U/μl) 80μl
2×Quick Ligation Buffer 1ml
10×T4 DNA Ligation Buffer 1ml
质量保证:
经多次柱纯化,SDS-PAGE胶检测仅可见清晰单一的目的条带;PCR方法检测无大肠杆菌DNA残留,无核酸内、外切酶污染。
活性定义:
在20μl的连接反应体系中, 6μg的λDNA-Hind III的分解物在16℃下反应30分钟时, 有90%以上的DNA片段被连接所需要的酶量定义为1个单位。
快速连接步骤:
  • 取50 ng载体和3倍摩尔量的插入片段,用双蒸水调整总体积为10μl。
  • 加入10μl 2×Quick Ligation Buffer,混匀。
  • 加入0.5~1μl T4 DNA连接酶,充分但轻柔混匀(切勿剧烈震荡,可能导致酶部分失活)。
  • 稍事离心,置于室温 (25℃) 作用5分钟。
  • 冰上放置,转化(如不立即进行转化实验请冻 存于-20℃)
For research use ONLY.