NovoRec® PCR一步定向克隆试剂盒(无缝克隆) (NR001)

目录 规格 价格
NR001-01A 20次 600
NR001-01B A包装X5 2000
产品描述:
NovoRec® PCR一步定向克隆试剂盒(无缝克隆)是近岸蛋白质科技最新研发的专利产品。该产品可以不依赖于连接酶,不受载体和目的片段的酶切位点限制,而直接用同源重组的方法,完成目的片段与载体相连接的基因克隆技术。该技术操作简单,PCR产物一步定向克隆,目的片段与载体无缝连接,反应时间短至20分钟,阳性率达到95%以上,让您轻松完成实验。
使用方法:
A.线性化载体的获得

线性化载体可以通过两种方法获得,不管采取哪种方法,最终线性化载体的 浓度需>15ng/μl。(高浓度的载体有利于提高效率)。
1、酶切选取合适的位点,单酶切或双酶切皆可,并且5´端突出,3´端突出或平末端均适用本Kit。
2、PCR 选取合适的位点,设计正向和反向引物,引物长度一般在18-20bp 左右,一般载体长度均大于3kb,建议用高保真的聚合酶扩增(推荐使用 Novoprotein pfu DNA 聚合酶,货号:E002)。为了避免模板质粒DNA对后续 试验的影响,建议载体酶切后再用PCR扩增,自连背景更低,阳性率更高。

B.目的片段获得

目的片段通常通过PCR获得。引物设计要保证目的片段两端有至少15bp序列与 线性化载体的两端一致,特殊应用引物设计请参照技术手册。为保证PCR扩 增的特异性及灵敏度,请尽可能选用pfu等高保真酶(推荐使用Novoprotein pfu DNA聚合酶,货号:E002)。PCR每条引物长度至少在35-40bp,包括5´ 端与载体同源的15bp以及目的片段特异性序列20-25bp,(注意事项:如果是 表达载体克隆构建,引物设计完全后,请注意检查读码框的正确)。引物设 计方法:使用NovoRec®PCR一步定向克隆试剂盒(无缝克隆)时,引物设计是很重要的,在设计引物时同样要遵循引物设计的基本原则,只不过上下游引物要加上15-18bp的载体同源序列。
载体同源序列如何添加主要分以下两种情况: (1)载体酶切后是5'端突出或平末端,则引物上的同源序列包括5'端突出部分的序列;(2)载体酶切后是3’端突出,则因无上的同源序列不包含突出部分。(如下图,红色碱基为希望保留原有的酶切位点所额外添加的碱基,不计算在15bp之内。

注:15bp同源序列不要求严格从载体最末端一届碱基计算,这是载体末端非同源序列将会被删除,同时导致重组效率的下降。当非同源序列达到20bp时,效率下降一半。

NovoRec引物设计方法
NovoRec一步定向克隆试剂盒(无缝克隆)引物设计方法
C.目的片段与载体的重组

1.将目的DNA片段和线性化载体以一定的摩尔比加到管子中 进行重组反应
2.混匀后在37℃放置20分钟;
3.立即进行转化,剩余连接液可保存在4℃或-20℃待用。(注意:1.目的片段与载体的摩尔比在3:1-10:1之间,摩尔比低于3:1效率会降低 2.反应时间在20-40分钟,时间太长不利于重组反应)

D.转化

建议所使用的感受态细胞效率要达到或>5X106 cfu/μg.
1.冰上融化一管100 μl的DH5a感受态细胞,轻弹管壁使细 胞重悬起来。加入10μl的反应液到感受态细胞中,轻弹数下,置冰上孵育45分钟。
2.42℃水浴中热激90秒后快速放入冰上5分钟。
3.加入500μl SOC液体培养基,37℃孵育45-60分钟。
4.5k离心3分钟收集菌体,根据需要将一定量的菌体均匀的涂布在含抗生素平板上。

E.阳性克隆鉴定

一般的,我们建议采用菌落PCR进行阳性克隆鉴定(推荐使用Novoprotein 2x specificTM Master Mix 货号:E010)。
鉴定引物的选择:为避免假阳性结果,我们建议一条引物为载体特异性引物,另一条引物为目的片段特异性引物。

产品包装(20次):
组成体积
NovoRec®重组酶20μl
10×重组缓冲液50μl
稳定性:
此Kit在4℃保存3天不影响使用效率。
保存条件:
收到后请立即离心;可在-20oC长期保存,避免反复冻融
常用反应体系(20μl)
组成体积
10×重组缓冲液2μl
NovoRec®重组酶1μl
线性化载体(>15ng/μl)N
插入片段N
线性化载体(>15ng/μl)N
ddH2O 至20μl
载体与目的片段摩尔比的计算:
载体与目的片段的摩尔比在1:3-1:10之间,如果摩尔比低于1:3,转化效率会下降。
摩尔比可登录到www.sinobio.net在线计算,也可根据以下公式计算:

NovoRec计算器
项目 体积 总量
载体 1ul 50.0ng
插入片段 0.9ul 45.5ng
10x缓冲液 5ul
ddH2O 42.1ul  
NovoRec酶 1ul  
合计 50ul  
请输入相关信息>>
载体总量: ng
载体大小: kb
载体浓度: ng/ul
插入片段长度: kb
片段浓度: ng/ul
载体/片段比例:
总反应体积: ul
参考文献

  • Liu D, Chen Y, Ding F, et al..
    Simultaneous production of butanol and acetoin by metabolically engineered< i> Clostridium acetobutylicum[J]..
    Metabolic engineering, 2015, 27: 107-114.(2015)

  • Ma M Z, Chu B F, Zhang Y, et al..
    Long non-coding RNA CCAT1 promotes gallbladder cancer development via negative modulation of miRNA-218-5p.
    Cell death & disease,2015, 6(1): e1583.(2015)

  • Xia Y, Niu Y, Cui J.
    The helicase activity of hyperthermophilic archaeal MCM is enhanced at high temperatures by lysine methylation.
    Frontiers in Microbiology(2015)

  • Yan-Fei Chen, Hongjun Chao, Ning-Yi Zhou.
    The catabolism of 2, 4-xylenol and p-cresol share the enzymes for the oxidation of para-methyl group in Pseudomonas putida NCIMB 9866. .
    Applied Microbiology and Biotechnology(2013)

  • Li F C, Gasser R B, Lok J B.
    Molecular characterization of the Haemonchus contortus phosphoinositide-dependent protein kinase-1 gene (Hc-pdk-1).
    Parasites & vectors(2016)

  • Chen W, Yu H, Ye L.
    Comparative Study on Different Expression Hosts for Alkaline Phytase Engineered in Escherichia coli.
    Applied biochemistry and biotechnology(2016)

  • Zhang W, Chen S, Liao Y, et al..
    Expression, purification, and characterization of formaldehyde dehydrogenase from Pseudomonas aeruginosa .
    Protein expression and purification(2013)
For research use ONLY.