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Fast Pfu DNA 聚合酶 (E031)

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产品描述:
Pfu DNA聚合酶为最常用的高保真DNA聚合酶,在需高保真的PCR反应中广范使用,然而Pfu酶扩增灵敏度不高,延伸速度缓慢(1kb/分钟)给众多的使用者带来了不便。针对普通Pfu酶的扩增缺陷, Novoprotein采用分子进化技术对普通Pfu酶进行改造,制备的新型聚合酶Fast Pfu酶具有快速、高灵敏度、抗干扰能力强等特点,是新一代的高保真DNA聚合酶。使用Fast Pfu能获得更理想的扩增结果,并大幅度缩短扩增反应时间。
产品特点:
  • 高保真:具有同Pfu酶相同的保真度,为普通Taq酶的10倍。
  • 快速:Fast Pfu扩增速度为普通Pfu酶的数倍,72℃保温30秒可延伸1kb以上。
  • 高效:以λDNA为模板,扩增长度可达12kb,能高效扩增≤6kb片段;对于人基因组DNA等复杂模板,能有效扩增出3kb特定基因片段。
  • 高灵敏:可从0.05ng人基因组DNA模板中扩增出1.2kb特定基因片段(图例一)。同样条件下对于基因组DNA的扩增显著优于普通Pfu酶。
  • 独特配方的5×Buffer:使PCR扩增反应更加稳定、灵敏、高效。
产品用途:
用于要求保真度比较高的PCR反应,包括克隆PCR、DNA片段拼接、引入突变、全基因合成、DNA末端补平等。
使用建议:
Fast Pfu DNA聚合酶产生的PCR产物为平滑末端,无3´端"A"突出,除使用NovoRec®一步定向无缝克隆外,其它PCR产物的克隆方案有:
  • PCR前引物进行5´端加磷修饰或将PCR产物磷酸化处理后再直接克隆于平滑末端的载体中。
  • 将产物3´末端加A后再与T载体连接。
• 由于Fast Pfu DNA聚合酶的校对活性可引起引物从3´ 端被部分 降解。因此在设计引物时应适当增加引物的长度,理想的引物长 度为20-30碱基。另外为了减少由3´→5´ 外切酶活性引起的引物降解,尽量在冰上配制反应体系,并最后加入Fast Pfu酶。
应用实例:
Fast Pfu DNA Polymerase Amplification
图例一) 50μl扩增体系中,分别以50ng~0.05ng人基因组DNA为模板,可对特定基因片段(1.2kb)进行很好的扩增。
泳道1:50ng; 泳道2:5ng; 泳道3:0.5ng;
泳道4:0.05ng; 泳道M:DNA Ladder 2000

产品包装:

组成体积
Fast Pfu DNA 聚合酶 (5U/μl)50μl
dNTP混合液(各10mM)*200μl
5×Fast Pfu Buffer with Mg2+2ml
*E031-02系列不含dNTP混合液

质量保证:

经多次柱纯化,SDS-PAGE胶检测仅可见清晰单一 的目的条带;PCR方法检测无大肠杆菌DNA残留, 无核酸内、外切酶污染。

活性定义:

在74℃条件下,30分钟内催化10nmol dNTP的掺入 反应成为酸不溶性物质所需的酶量为一个单位。

常用反应体系(50μl)

组分体积
5×Fast Pfu Buffer*10μl
上游引物0.2-1.0μM(终浓度)
下游引物0.2-1.0μM(终浓度)
dNTP(各10mM)1.0μl
模板1-50ng(质粒)
10ng-1μg(基因组)
Fast Pfu0.25μl(1.25U)
ddH2O至50μl
*Mg2+终浓度为2mM

常用PCR循环:

当扩增片段<3K:
94℃1分钟30秒
30次循环94℃,20秒
57℃ 20秒
72℃ 根据产物长度调整, 30秒/kb
72℃3分钟
4℃保温
当扩增片段≥3K(推荐引物长度≥30bp):
94℃1分钟30秒
30次循环 94℃,5秒
68℃ 根据产物长度调整, 30秒/kb
72℃5分钟
4℃保温
For research use ONLY.