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KOF DNA聚合酶 (E003)

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产品描述:

KOF DNA Polymerase 是一种经过基因工程改造的高保真DNA聚合酶,具有极强的3'→5'核酸外切酶活性(Proof-reading活性),当聚合反应发生碱基错配时,聚合酶的校正活性可将错配的碱基切除。与普通pfu相比,保真性更高,约为普通taq的50倍,普通pfu的6倍。其扩增性能也比普通Pfu高,成功克服了普通pfu酶扩增效率低的缺陷。

产品用途:

用于要求保真度高的PCR反应,包括克隆PCR,DNA片段拼接,引入突变,全基因合成,DNA片段的补平等。

使用建议:

KOF DNA Polymerase 产生的PCR产物为平滑末端,无3’端“A”突出,其PCR产物的克隆有几种方案。

  • PCR前引物进行5’ 加磷修饰或将PCR产物磷酸化处理后再直接克隆于平滑末端的载体中(参见实验方案)。
  • 将产物3’ 末端加A后再与T载体连接(参见实验方案)。
  • 引物中引入15bp与载体同源序列,利用NovoRec PCR产物一步定向无缝克隆试剂盒(Cat#NR001)直接连接到目的载体。

由于KOF DNA聚合酶的校正活性可引起引物从3’ 端被部分降解。因此在设计引物时应适当增加引物的长度,理想的引物长度为20-30bp。另外为了减少由3’→5’外切酶活性引起的引物降解,尽量在冰上配制反应体系,并最后加入KOF酶。

应用实例:
KOF DNA Polymerase Amplification
图例一)50ul扩增体系中,以5ngλDNA为模板,对0.6kb~12.0kb片段的扩增结果。
泳道1:0.6kb;泳道2:1.0kb;泳道3:2.0kb;泳道4:3.0kb;泳道5:4.0kb; 泳道6:8.0kb;泳道7:10.0kb;泳道8:12.0kb;泳道M:1kb DNA Marker;
KOF DNA Polymerase Amplification
图例二)50ul扩增体系中,分别以50ng~0.05ng质粒为模板进行的灵敏度的扩增结果。
泳道1:50ng;泳道2:5ng;泳道3:0.5ng;泳道4:0.05ng;泳道M:DNA 2000 ladder

产品包装:

KOF DNA 聚合酶(1U/ul)250ul
dNTP混合液250ul
10X KOF Buffer with Mg2+2ml

质量保证:

经过多次柱纯化,SDS-PAGE检测纯度大于95%;PCR方法检测无大肠杆菌DNA残留,无核酸内,外切酶污染。

活性定义:

在74℃条件下,30分钟内催化10nmol dNTP的掺入反应成为酸不溶性物质所需的酶量为一个单位。

常用反应体系(50μl)
10X KOF Buffer5μl
上游引物0.2-1.0μM(终浓度)
下游引物0.2-1.0μM(终浓度)
dNTP(各10mM)1.0μl
模板1-50ng(质粒)
10ng-1μg(基因组)
KOF1μl
ddH2O至50μl

常用PCR循环:

当扩增片段<3K:
94 C 1分钟30秒
30次循环94℃,20秒/
57℃ 20秒/
72℃ 根据产物长度调整,60秒/kb
72℃5分钟
4℃保温
当扩增片段≥3K(推荐引物长度≥30bp):
94 C20秒
30次循环 94℃,5秒/
68℃ 根据产物长度调整,60秒/kb
72℃5分钟
4℃保温
For research use ONLY.