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Pfu DNA 聚合酶 (E002)

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产品描述:
本酶为Pyrococcus furiosus中分离的pfu DNA pol基因在大肠杆菌中进行表达后经多步纯化分离而得。Pfu DNA聚合酶具有3´→5´外 切酶(校正)活性,当聚合反应发生碱基错配时,聚合酶的校正活性可将错配的碱基切除。Pfu DNA聚合酶为使用范围最广的高保真DNA聚合酶,其错误率仅为1.3x10-6,推荐Pfu DNA聚合酶用于需高保真的PCR反应。
产品用途:
用于要求保真度比较高的PCR反应,包括克隆PCR、DNA片段拼接、引入 突变、全基因合成,DNA片段的补平等(参见实验方案)。
使用建议:
Pfu DNA聚合酶产生的PCR产物为平滑末端,无3´端"A"突出,其PCR产 物的克隆有几种方案。
  • PCR前引物进行5´端加磷修饰或将PCR产物磷酸化处理后再直接克隆 于平滑末端的载体中(参见实验方案)。
  • 将产物3´末端加A后再与T载体连接(参见实验方案)。
  • 引物中引入15bp与载体同源序列,利用NovoRec® PCR产物一步定向无缝克隆试剂盒(Cat# NR001)直接连接到目的载体。
由于Pfu DNA聚合酶的校对活性可引起引物从3´端被部分降解。因此在设计引物时应适当增加引物的长度,理想的引物长度为20-30碱基。另外为了减少由3´→5´外切酶活性引起的引物降解,尽量在冰上配制反应体系,并最后加入Pfu酶。
应用实例:
Taq DNA Polymerase Amplification
图例一)50μl扩增体系中,以5ngλDNA为模板,对500bp~6.0kb片段的扩增结果。
泳道1:0.5kb; 泳道2:1.0kb; 泳道3:2.0kb;泳道4:3.0kb; 泳道5:4.0kb; 泳道6:6.0kb 泳道M:1kb DNA Marker;
Taq DNA Polymerase Amplification
图例二) 50μl扩增体系中,分别以50ng~0.05ng人基因组DNA为模板,可对特定基因片段(380bp)进行很好的扩增。
泳道1:50ng;泳道2:5ng;泳道3:0.5ng;泳道4:0.05ng;泳道M:DNA 2000 Ladder

产品包装:

Pfu DNA 聚合酶(5U/μl)50μl
dNTP混合液(各10mM)*200μl
10×Pfu DNA Buffer with Mg2+2ml
*E002-02系列不含dNTP混合液

质量保证:

经多次柱纯化,SDS-PAGE检测纯度大于95%;PCR 方法检测无大肠杆菌DNA残留,无核酸内、外切酶 污染。

活性定义:

在74℃条件下,30分钟内催化10nmol dNTP的掺入反应成为酸不溶性物质所需的酶量为一个单位。


常用反应体系:

10×Pfu Buffer5μl
上游引物0.2-1.0μM(终浓度)
下游引物0.2-1.0μM(终浓度)
dNTP(各10mM)1.0μl
模板1-50ng(质粒)
10ng-1μg(基因组)
Pfu0.25μl(1.25U)
0.25μl(1.25U)
ddH2O至50μl
*Mg2+终浓度为1.5mM

常用PCR循环:

当扩增片段<3K:
94 C 1分钟30秒
30次循环94℃,30秒
57℃,30秒
72℃,根据产物长度调整, 60秒/kb
72℃5分钟
4℃保温
当扩增片段≥3K(推荐引物长度≥30bp):
94 C20秒
30次循环 94℃,5秒
68℃,根据产物长度调整, 60秒/kb
72℃5分钟
4℃保温
For research use ONLY.