2×Pfu Master Mix (E006)

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产品描述:
本制品是将PCR反应所需的Pfu酶、dNTP、MgCl2、反应缓冲液以及优化剂以及稳定剂,预先配制成2倍浓度的混合物。2×Pfu Master Mix专为扩增克隆DNA片段优化,高保真,错误率仅为1.3×10-6。使用 时只需在加入模板和引物并稀释到1倍浓度即可进行PCR反应,非常方便。
产品特点:
  • 高保真:Pfu DNA聚合酶是使用最广泛的高保真酶,其保真度为普通Taq酶的10倍
  • 灵敏:可从0.05ng人基因组DNA模板中扩增出特定基因片段(图例一)
  • 快捷:PCR反应所必需试剂全集于一管之中,数分钟即可完成反应
  • 便利:10μl,25μl 或50μl体系全部适用
产品用途:
用于要求保真度比较高的PCR反应,包括克隆PCR、DNA片段拼接、引入突变、全基因合成等。
使用建议:
Pfu DNA聚合酶产生的PCR产物为平滑末端,无3´端"A"突出,其PCR产 物的克隆有几种方案。
  • PCR前引物进行5´端加磷修饰或将PCR产物磷酸化处理后再直接克隆 于平滑末端的载体中(参见实验方案)。
  • 将产物3´末端加A后再与T载体连接(参见实验方案)。
  • 引物中引入15bp与载体同源序列,利用NovoRec® PCR产物一步定向无缝克隆试剂盒(Cat# NR001)直接连接到目的载体。
由于Pfu DNA聚合酶的校对活性可引起引物从3´端被部分降解。因此在设计引物时应适当增加引物的长度,理想的引物长度为20-30碱基。另外为了减少由3´→5´外切酶活性引起的引物降解,尽量在冰上配制反应体系,并最后加入Pfu酶。
应用实例:
Taq DNA Polymerase Amplification
图例一)5 0 μ l 扩增体系中,分别以50ng~0.05ng人基因组DNA为模板,可对特定基因片段(380bp)进行很好的扩增。
泳道1:50ng; 泳道2:5ng; 泳道3:0.5ng;泳道4:0.05ng; 泳道M:DNA Ladder 2000

产品包装(A包装):

组成体积
2xPfu Master Mix1ml×1支

常用反应体系(50μl)

组分体积
2×Master Mix*25μl
上游引物0.2-1.0μM(终浓度)
下游引物0.2-1.0μM(终浓度)
模板1-50ng(质粒)
10ng-1μg(基因组)
ddH2O 至50μl
*Mg2+终浓度为2mM

常用PCR循环:

当扩增片段<3K:
94 C 1分钟30秒
30次循环94℃,30秒
57℃,30秒
72℃,根据产物长度调整, 60秒/kb
72℃5分钟
4℃保温
当扩增片段≥3K(推荐引物长度≥30bp):
94 C20秒
30次循环 94℃,5秒
68℃,根据产物长度调整, 60秒/kb
72℃5分钟
4℃保温
For research use ONLY.