NovoScript®SYBR Two-Step qRT-PCR SuperMix (E093)

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产品描述:

NovoScript® Two-Step qRT-PCR SuperMix两步法RT-qPCR试剂盒基于本公司生产的NovoScript® All- in-one 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix (novoprotein货号:E043)和NovoStart® SYBR qPCR SuperMix(novoprotein货号:E090),具有灵敏度高,合成能力强,扩增效率高的优点。
该试剂盒能以动物、植物和微生物的总RNA或mRNA为模板,用NovoScript® All- in-one 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix进行反转录,用NovoScript® SYBR qRT-PCR SuperMix进行荧光定量。
本制品配有不同浓度的ROX Reference Dye,用于不同仪器校正孔与孔之间产生的荧光信号误差。

操作方法:
  • 第一链cDNA合成

    融化后,将试剂盒中各组分混匀并稍微离心后置于冰上。

    • 按顺序加入下面的反应物
      模板RNA总RNA(0.1 ng -5μg)
      poly(A) mRNA(10 pg)
      特异性RNA(0.01 pg)
      2×NovoScript® All-in-one 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix10μl
      RNase Free Water至20μl
    • 可选优化步骤。如果RNA模板GC含量高或者含有二级结构,可先将模板和引物的混合液轻轻混匀,短暂离心,65℃孵育5分钟,冰上冷却。
    • 轻柔混匀后离心。如果RNA模板中不含poly A结构,25℃先孵育5分钟,随后42℃孵育60分钟。
    • 70°C加热5min终止反应。

      反应产物可直接用于PCR反应,如果不立即使用,在-20°C可保存一周左右。如想延长保存时间,建议使用-70°C 保存。

  • 实时定量

    合成的第一链cDNA可直接用于PCR或qPCR。第一链cDNA反应液体积不能超过PCR反应体系的1/10。通常50 μl的PCR反应体系中,第一链cDNA反应液加入2μl。

  • 用ROX Reference Dye I校准的Real Time PCR仪有:

    Applied Biosystems 5700/7000/7300/7700/7900/7900 HT/7900 HT Fast;Applied Biosystems StepOne/StepOne Plus;其他仪器。

  • 用ROX Reference Dye II校准的Real Time PCR仪有:

    Applied Biosystems 7500/7500 Fast;Stratagene MX4000/MX3500P/MX3000P;其他仪器。

  • 不需要用ROX Reference Dye校准的Real Time PCR仪有:

    Bio-Rad CFX96/CFX 384/iCycler iQ5/ iQ /My iQ5/MiniOpticon/Opticon/Opticon /Chromo4;Eppendorf MasterCycler realplex/ realplex 2s。Cepheid SmartCycler;Illumina Eco qPCR;Roche Applied Science LightCycler 480;Thermo Scientific PikoReal Cycler;Qiagen/Corbett Rotor-Gene Q/Rotor-Gene 3000/ Rotor-Gene 6000;其他仪器。

注意事项:
  • 用DEPC处理实验用到的所有器材,或者购买已经证明无核酸酶的实验用具,整个实验过程需戴手套并经常更换手套,避免RNA酶的污染。
  • 确保所用试剂中无RNA酶污染。
  • 试剂盒如不使用,要严格密封保存。在反转录过程中,所有管盖要确保扣严。
  • 纯化过的RNA要保证不含有盐,金属离子,乙醇和苯酚,因为以上成分会干扰第一链cDNA的合成反应。可采用乙醇沉淀法去除痕量污染物。
产品包装(A包装):
产品组成体积
2×NovoStart® SYBR qPCR SuperMix1ml×3支
NovoScript® All- in-one 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix500μl
RNase Free Water1ml×5支
ROX Reference Dye I200μl
ROX Reference Dye II 200μl
保存温度:
-20 ℃
常用反应体系(20μl):
2×NovoScript®SYBR One-Step qRT-PCR SuperMix 10μl
NovoScript®RT Enzyme Mix1μl
上游引物0.2-1.0μM(终浓度)
下游引物0.2-1.0μM(终浓度)
模板1-2μl
RNase Free Water至20μl
常用反应体系(20μl)
2×NovoStart® SYBR qPCR SuperMix10μl
上游引物0.2-1.0μM(终浓度)
下游引物0.2-1.0μM(终浓度)
模板1-2μl
RNase Free Water至20μl
常用PCR循环:
两步法扩增程序(推荐):
42℃30min
94℃5min
35-40次循环 95℃,15s
60℃,1min
三步法PCR扩增程序(引物Tm值较低或其他原因):
42℃30min
94℃ 5min
35-40次循环 95℃,15s
57℃,20s
72℃,30s
For research use ONLY.