NovoScript® 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix (E041)

目录 规格 价格
产品描述:

第一链cDNA合成试剂盒是以mRNA或者总RNA为模板,高效合成第一链cDNA。本试剂盒使用M-MuLV反转录酶(E123),它的RNA酶H的活性与AMV反转录酶相比较低。该反转录酶可耐受42-50°C温度.试剂盒中含有重组RNA酶抑制剂(E055),可耐受55°C高温,有效防止RNA降解。试剂盒同时含有Oligo(dT)18,只以有poly(A)尾巴的mRNA为模板合成cDNA,使用本试剂盒也可采用序列特异性引物。合成的第一链cDNA能直接用作PCR或荧光定量PCR的模板,第二链cDNA的合成或线性RNA扩增,也可用于需要用带有放射性或非放射性核苷酸标记第一链cDNA的实验。

注意事项:
  • 用DEPC处理实验用到的所有管子和枪头,或者购买已经证明无核酸酶的实验用具,整个实验过程戴手套并经常更换手套,避免RNA酶的污染。
  • 确保所用试剂及超纯水中无RNA酶污染。
  • 纯化过的RNA要保证不含有盐,金属离子,乙醇和苯酚,因为以上成分会干扰第一链cDNA的合成反应。可采用乙醇沉淀RNA的方法去除掉痕量污染物。
实验步骤:

I.第一链cDNA合成

融化后,将试剂盒中各组分混匀并稍微离心,离心后置于冰上。

  • 按顺序加入右表中的反应物。
  • 可选优化步骤。如果RNA模板GC含量高或者含有二级结构,可先将模板和引物的混合液轻轻混匀,短暂离心,65°C 孵育5分钟,冰上冷却,离心,再置于冰上冷却。
  • 轻轻混匀,离心。
  • 如果使用Oligo(dT)18或者基因特异型引物,42°C孵育60分钟。如果使用随机六聚体引物,25°C.先孵育5分钟,随后42°C孵育60分钟。
  • 70°C加热5 min终止反应。

反应产物可直接用于PCR反应或者在-20°C 保存少于一周的时间。如想延长保存时间,建议使用-70°C 保存。

II.第一链cDNA的PCR扩增

合成的第一链cDNA可直接用于PCR或qPCR。第一链cDNA反应液体积不能超过PCR反应体系的1/10。通常50 μl的PCR反应体系中,第一链cDNA反应液加入2μl。

应用实例:
第一链cDNA合成试剂盒
图例一)小鼠胚胎肝脏总RNA抽提。
按novoprotein RNA抽提试剂盒操作说明书抽提,起始组织量50mg;
GAPDH RT-PCR扩增
图例二)Novoprotein 第一链cDNA合成后PCR扩增目的基因。
泳道1:某进口品牌;泳道2:Novoprotein 第一链cDNA合成试剂盒扩增结果。(1ug总RNA反转录后,取1ul用于PCR检测,目的基因:GAPDH)

产品包装:

第一链cDNA合成试剂盒20次100次
M-MuLV反转录酶(200 U/μl)25μl120 μl
RNA酶抑制剂(40 U/μl)25 μl120 μl
5xM-MuLV Buffer150 μl500 μl
dNTP(10mM)50 μl250 μl
Oligo(dT)18(100 μM)25 μl120 μl
GAPDH正向引物(10 uM)20 μl20 μl
GAPDH反向引物(10 uM)20 μl20 μl
Water,nuclease-free2x1.25 ml2x1.25 ml
*2×RT-PCR Reaction Buffer中包含Taq DNA聚合酶、dNTP、Mg2+、RNase Inhibitor以及反应缓冲液。
常用反应体系(20μl)
模板RNA总RNA(0.1 ng - 5 μg)
poly(A) mRNA(10 pg - 0.5 μg)
特异性RNA(0.01 pg - 0.5 μg)
引物Oligo (dT)18引物1μl
随机六聚体引物1 μl
基因特异性引物15-20 pmol
5xReaction Buffer4ul
RNA酶抑制剂(20U/ul)1ul
dNTP(各10mM)2.0μl
M-MuLV反转录酶(200U/ul)1μl
ddH2O(Nuclease Free)至20μl
For research use ONLY.