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NovoScript® Reverse Transcriptase (E123)

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产品描述:

本制品是通过基因重组技术克隆表达的缺失突变型RNase H-的M-MuLV反转录酶。一般的野生型M-MuLV(Moloney Murine Leukemia Virus)具有以下几种活性:依赖于RNA的DNA聚合酶活性;依赖于DNA的DNA聚合酶活性;RNase H活性。由于RNase H能够催化降解DNA/RNA杂合体中的RNA,因此在cDNA第一条链的合成反应中可能会降解RNA/DNA杂合体中的模板RNA。本酶的RNase H活性缺失,延伸能力强,可用于较长的cDNA合成,高比例的全长cDNA文库的构建以及Real Time RT-PCR反应等。

产品用途:
  • 1st-Strand cDNA的合成。
  • cDNA Probe的制备。
  • RT-PCR反应以及Realtime RT-PCR反应。
  • 诊断试剂。
注意事项:
  • 用DEPC处理实验用到的所有管子和枪头,或者购买已经证明无核酸酶的实验用具,整个实验过程戴手套并经常更换手套,避免RNA酶的污染。
  • 确保所用试剂及超纯水中无RNA酶污染。
  • 纯化过的RNA要保证不含有盐,金属离子,乙醇和苯酚,因为以上成分会干扰第一链cDNA的合成反应。可采用乙醇沉淀RNA的方法去除掉痕量污染物。
实验步骤:
第一链cDNA合成反应体系:

1.按右侧表格顺序加入的反应物。

2.可选优化步骤。如果RNA模板GC含量高或者含有二级结构,可先将模板和引物的 混合液轻轻混匀,短暂离心,65°C 孵育5分钟,冰上冷却,离心,再置于冰上冷却。

3. 轻轻混匀,离心。

4. 如果使用Oligo(dT)18或者基因特异型引物,42℃孵育60分钟。如果使用随机六聚体引物,25°C先孵育5分钟,随后42℃孵育60分钟。

5. 75°C加热5 min终止反应。

反应产物可直接用于PCR反应或者在-20°C 保存少于一周的时间。如想延长保存时间,建议使用-70°C 保存。

应用实例:
M-MuLV RT-PCR
图例一)小鼠胚肝总RNA RT-PCR扩增。
泳道1-6总RNA量分别为10ng,1ng,0.1ng,0.01ng,0.001ng,0ng;20ul体系中反转录后取1ul用于PCR扩增。目的基因:GAPDH。

产品包装:

M-MuLV反转录酶(200 U/μl)25μl
5×M-MLV Buffer1ml

质量保证:

经多次柱纯化,SDS-PAGE检测纯度大于95%,PCR方法检测无大肠杆菌DNA残留,无核酸内、外切酶污染。

活性定义:

以Poly(rA)•Oligo(dT)为模板/引物,在37℃、10分钟条件下,掺入1 nmol的[3H] dTTP所需要的酶量定义为1个活性单位(U)。

常用反应体系:

 
模板RNA总RNA(0.1 ng - 5 μg)
poly(A) mRNA(10 pg - 0.5 μg)
特异性RNA(0.01 pg - 0.5 μg)
引物Oligo (dT)18引物1μl
随机六聚体引物1 μl
基因特异性引物15-20 pmol
5xReaction Buffer4ul
RNA酶抑制剂(20U/ul)1ul
dNTP(各10mM)2.0μl
M-MuLV反转录酶(200U/ul)1μl
ddH2O(Nuclease Free)至20μl
For research use ONLY.