第一链cDNA合成试剂盒是以mRNA或者总RNA为模板，高效合成第一链cDNA。本产品含有反转录反应所需的全部试剂（NovoScript® Reverse Transcriptase，RNase Inhibitor，Oligo(dT)18，Random N6，dNTPs），浓度为2×。反应时只需要加入RNA模板和水即可，操作简单，降低操作过程中的污染。合成的第一链cDNA能直接用做PCR或荧光定量PCR的模板，以及第二链cDNA合成或线性RNA扩增的模板，也可用于放射性或非放射性核苷酸标记第一链cDNA的实验。

• 第一链cDNA合成

融化后，将试剂盒中各组分混匀并稍微离心后置于冰上。

• 按顺序加入下面的反应物
  

  模板RNA	总RNA(0.1 ng -5μg)
  	poly(A) mRNA(10 pg)
  	特异性RNA(0.01 pg)
  2×NovoScript® All-in-one Supermix	10μl
  RNase Free Water	至20μl

• 可选优化步骤。如果RNA模板GC含量高或者含有二级结构，可先将RNA模板和RNase Free Water混匀后，65°C 孵育5分钟，冰上冷却后再加入其它组分。
• 轻柔混匀后离心，于42°C条件下孵育60分钟。 如果RNA模板中不含poly A结构，可先在25°C条件下孵育5分钟，随后转到42°C条件下孵育60分钟。
• 70°C加热5min终止反应。



反应产物可直接用于PCR反应，如果不立即使用，在-20°C可保存一周左右。如想延长保存时间，建议使用-70°C 保存。

• 第一链cDNA的PCR扩增



合成的第一链cDNA可直接用于PCR或qPCR。第一链cDNA反应液体积不能超过PCR反应体系的1/10。通常50 μl的PCR反应体系中，第一链cDNA反应液加入2μl。

• 用DEPC处理实验用到的所有器材，或者购买已经证明无核酸酶的实验用具，整个实验过程需戴手套并经常更换手套，避免RNA酶的污染。
• 确保所用试剂中无RNA酶污染。
• 试剂盒如不使用，要严格密封保存。在反转录过程中，所有管盖要确保扣严。
• 纯化过的RNA要保证不含有盐，金属离子，乙醇和苯酚，因为以上成分会干扰第一链cDNA的合成反应。可采用乙醇沉淀法去除痕量污染物。