NovoScript®II Reverse Transcriptase (E126)

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产品描述:

本制品是在novoprotein普通M-MLV(RNase H-)逆转录酶基础上,进一步进行遗传改造,除保留普通M-MLV(RNase H-)的特性外,极大的提高了其热稳定性,其最适反应温度由普通M-MLV(RNase H-)逆转录酶的42℃提高到65℃,并且常温保存24小时仍然具有良好的逆转录活性。该制品还极大的缩短了逆转录时间,逆转录10min即可得到至少1500bp目的基因条带。该制品转录效率高,热稳定性好,反应时间短,可用于GC含量高或者具有二级结构的RNA的逆转录,稀有样品的逆转录等。

产品用途:
  • 1st-Strand cDNA的合成。
  • cDNA Probe的制备。
  • RT-PCR反应以及一步法RT-PCR。
  • qPCR。
  • 诊断试剂。
注意事项:
  • 用DEPC处理实验用到的所有管子和枪头,或者购买已经证明无核酸酶的实验用具,整个实验过程戴手套并经常更换手套,避免RNA酶的污染。
  • 确保所用试剂及超纯水中无RNA酶污染。
  • 纯化过的RNA要保证不含有盐,金属离子,乙醇和苯酚,因为以上成分会干扰第一链cDNA的合成反应。可采用乙醇沉淀RNA的方法去除掉痕量污染物。
实验步骤:
第一链cDNA合成反应体系:

1.按右表顺序加入反应物。

2.可选优化步骤。如果RNA模板GC含量高或者含有二级结构,可先将模板和引物的 混合液轻轻混匀,短暂离心,65°C 孵育5分钟,冰上冷却,离心,再置于冰上冷却。

3. 轻轻混匀,离心。

4. 如果使用Oligo(dT)18或者基因特异型引物,42°C-65℃孵育60分钟。 如果使用随机六聚体引物,25°C先孵育5分钟,随后42°C-65℃孵育60分钟。

5. 75°C加热5 min终止反应。

反应产物可直接用于PCR反应或者在-20°C 保存少于一周的时间。如想延长保存时间,建议使用-70°C 保存。

应用实例:
ThermoStable M-MuLV RT-PCR
图例一)耐高温M-MuLV反转录酶应用效果。
以1ug小鼠胚胎总RNA逆转录后,取1ul逆转录产物进行GAPDH(500bp)和小鼠RNA酶抑制剂基因(1500bp)进行PCR扩增,反应体系:20ul。

产品包装:

耐高温M-MuLV反转录酶(200 U/μl) 25μl
5×M-MLV Buffer 1ml

质量保证:

经多次柱纯化,SDS-PAGE检测纯度大于95%,PCR方法检测无大肠杆菌DNA残留,无核酸内、外切酶污染。

活性定义:

以Poly(rA)•Oligo(dT)为模板/引物,在55℃、10分钟条件下,掺入1 nmol的[3H] dTTP所需要的酶量定义为1个活性单位(U)。

常用反应体系:

 
模板RNA 总RNA(0.1 ng - 5 μg)
poly(A) mRNA(10 pg - 0.5 μg)
特异性RNA(0.01 pg - 0.5 μg)
引物 Oligo (dT)18引物1μl
随机六聚体引物1 μl
基因特异性引物15-20 pmol
5xReaction Buffer 4ul
RNA酶抑制剂(20U/ul) 1ul
dNTP(各10mM) 2.0μl
耐高温M-MuLV反转录酶(200U/ul) 1μl
ddH2O(Nuclease Free) 至20μl
For research use ONLY.