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NovoScript® 1st Strand cDNA Synthesis Kit gDNA Purge (E042)

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产品描述:

第一链cDNA合成试剂盒(去基因组)是以mRNA或者总RNA为模板,高效合成第一链cDNA。本试剂盒使用NovoScript® Reverse Transcriptase反转录酶(novoprotein目录号:E123),其RNase H活性低于AMV反转录酶,但可耐受42-50°C的温度。试剂盒中含有重组RNA酶抑制剂(novoprotein目录号:E125),可耐受55°C高温,有效防止RNA降解。本制品含有去除基因组的成分gDNA Removal,在以RNA为模板进行cDNA第一链合成时,可以同步去除基因组DNA。反应结束后于85℃加热5秒钟即可失活反转录酶、RNA酶抑制剂和gDNA Removal。

操作方法:

第一链cDNA合成:
融化后,将试剂盒中各组分混匀并稍微离心后置于冰上。

  • 按顺序加入下面的反应物
    模板RNA 总RNA(0.1 ng -5μg)
      poly(A) mRNA(10 pg)
      特异性RNA(0.01 pg)
    引物 Oligo (dT)18 1 μl
      Random N6 1 μl
      基因特异性引物15-20 pmol(0.01 pg)
    5×NovoScript®RT Buffer 4μl
    RNase Inhibitor 1μl
    gDNA Purge 1μl
    dNTPs(10mM) 2μl
    NovoScript® Reverse Transcriptase 1μl
    RNase Free Water 至20μl
  • 可选优化步骤。如果RNA模板GC含量高或者含有二级结构,可先将模板和引物的混合液轻柔混匀,短暂离心,于65°C 条件下孵育5分钟后在冰上冷却。
  • 轻柔混匀后离心。
  • 如果使用Oligo(dT)18或者基因特异型引物,需在42°C条件下孵育60分钟。如果使用随机六聚体引物,则要先在25°C条件下孵育5分钟后转为42°C孵育60分钟。
  • 70°C加热5min终止反应。
    反应产物可直接用于PCR反应,如果不立即使用,在-20°C可保存一周左右。如想延长保存时间,建议使用-70°C 保存。

第一链cDNA的PCR扩增:
合成的第一链cDNA可直接用于PCR或qPCR。第一链cDNA反应液体积不能超过PCR反应体系的1/10。通常50 μl的PCR反应体系中,第一链cDNA反应液加入2μl。

注意事项:
  • 用DEPC处理实验用到的所有器材,或者购买已经证明无核酸酶的实验用具,整个实验过程需戴手套并经常更换手套,避免RNA酶的污染。
  • 确保所用试剂中无RNA酶污染。
  • 试剂盒如不使用,要严格密封保存。在反转录过程中,所有管盖要确保扣严。
  • 纯化过的RNA要保证不含有盐,金属离子,乙醇和苯酚,因为以上成分会干扰第一链cDNA的合成反应。可采用乙醇沉淀法去除痕量污染物。
产品包装(A包装):
产品组成 体积
NovoScript® Reverse Transcriptase (200U/μl) 50μl
RNase Inhibitor(40U/μl) 50μl
gDNA Purge 50μl
5×NovoScript®RT Buffer 1ml
dNTPs(10mM) 200μl
Oligo(dT)18(100uM) 100μl
Random N6(100uM) 100μl
GAPDH正向引物(10μM) 20μl
GAPDH反向引物(10μM) 20μl
RNase Free Water 1ml
保存温度:

-20 ℃

For research use ONLY.